在反相 HPLC 中，如果成功分離的條件未知，建議運行搜索梯度。 這種運行是在 30-50 分鐘內從 10% 到 80% 的有機改性劑進(jìn)行的，使用洗脫強度的線(xiàn)性增加。 根據此篩選梯度的結果，可以選擇合適的流動(dòng)相組成進(jìn)行等度洗脫，或者必須遵循合適的梯度。

可以選擇梯度洗脫來(lái)分離極性差異很大的化合物。 根據經(jīng)驗，如果在超過(guò) 25% 的篩選梯度期間可以檢測到峰，則梯度洗脫可能是該分離的zui佳選擇。 如果峰出現的時(shí)間小于搜索梯度的 25%，則應首 選等度洗脫，因為在等度條件下選擇性始終較高。

如果樣品由兩組不同的化合物組成，分步洗脫可以獲得良好的分離結果。 在這種情況下，首先采用等度流動(dòng)相洗脫，這樣可以為較少保留的一組化合物提供令人滿(mǎn)意的分離結果，然后在一個(gè)步驟中將流動(dòng)相的洗脫強度增加到這樣一個(gè)程度，即可以將保留較多的一組化合物分離出來(lái)。一種適當的方式。 階梯梯度也可用于在每次進(jìn)樣后清洗色譜柱。 在這種情況下，洗脫強度在zui后一個(gè)峰洗脫后急劇增加。 然后可以從色譜柱中去除強保留的雜質(zhì)。