Sephadex LH-20使用說(shuō)明
1 Sephadex G型葡聚糖凝膠只適合在水中使用，SephadexG-25羥丙化后就是SephadexLH-20。其既有分子篩作用，在由極性與非極性溶劑組成的溶劑中還有反相層析效果。雖然價(jià)位很高，但由于性能頗佳，可再生利用，所以倍受親睞。此外上柱樣品損失很少，對處理小樣品較好，這也是實(shí)驗室常用的原因之一。

2Sephadex LH20 的原理。

SephadexLH20的分離原理主要有兩方面：以凝膠過(guò)濾作用為主，兼具反相分配的作用（在反相溶劑中）。因為凝膠過(guò)濾作用，所以大分子的化合物保留弱，先被洗脫下來(lái)，小分子的化合物保留強，*后出柱。如果使用反相溶劑洗脫，SephadexLH20對化合物還起反相分配的作用，所以極性大的化合物保留弱，先被洗脫下來(lái)，極性小的化合物保留強，后出柱。如果使用正相溶劑洗脫，這主要靠凝膠過(guò)濾作用來(lái)分離。

3Sephadex LH20 洗脫溶劑。

SephadexLH20 洗脫溶劑因分為兩類(lèi)：反相和正相兩種。用得*多的是反相溶劑洗脫，以甲醇－－水系統*為常見(jiàn)，先用水，逐漸增加甲醇比例，*后用100％甲醇沖柱。正相系統以氯仿－－甲醇*為常見(jiàn)，先用50％氯仿－－甲醇，逐漸增加甲醇比例，*后用100％甲醇沖柱。

4Sephadex LH20 樣品的處理和洗脫溶劑的選擇。

如果樣品極性大，這選用反相溶劑洗脫（甲醇－水），樣品用*少體積的甲醇－水（盡可能甲醇少一些）溶解，過(guò)濾后，濕法上樣（一定要濾！要是把Sephadex LH20 堵啦，就得將SephadexLH20 的柱頭部分棄去）。如果樣品極性小，這選用正相溶劑洗脫（氯仿－甲醇），樣品用*少體積的氯仿－甲醇溶解，過(guò)濾后，濕法上樣。

5Sephadex LH-20的步驟。

(1)選擇條件：

梯度洗脫在Sephadex使用中并不象在正相柱層析中那么重要。首先你的樣品須要能溶解在盡量少量的洗脫劑中。極性在的用甲醇水系統;極性小者一般用不含水的系統。我們實(shí)驗室常用正己烷二氯甲烷甲醇系統，用了很多年，效果較好。

(2)飽和層析柱：

用洗脫劑將凝膠搖勻，直立柱身，讓其自然沉降，此時(shí)要防止氣泡留在其中。至少半小時(shí)打開(kāi)開(kāi)關(guān)，流出幾個(gè)柱體種的洗脫劑，目的是使其膨脹在正確比例的洗脫劑中。

(3)樣品處理：用盡量少的洗脫劑溶解樣品，常壓過(guò)濾。

(4)濕法上柱。這也是要有技巧的步驟。

(5)洗脫：控制流速，一般1drop/s以下，可參見(jiàn)廠(chǎng)家的一些參數;必要時(shí)更改極性（很多時(shí)一個(gè)極性就可以將樣品洗脫完畢）。再生以備下次使用。

6分離的技巧

（1） 流速不可太快，切切不可新急，所謂欲速則不達。

（2）柱子盡可能長(cháng)， SephadexLH20 柱長(cháng)的增加將極大地改善分離，所不要吝惜填料，寧可將填料全裝在一根大柱子中，不要將填料裝成幾根小柱。

（3） 餾分一定要接的細，可1／10，或1／20個(gè)保留體積接成一餾分。

（4） 洗脫體積一般為2-3個(gè)保留體積，對特殊保留強的化合物，可洗脫5個(gè)保留體積。

（5）鞣質(zhì)成分死吸附嚴重，不建議用LH20分鞣質(zhì)。

（6）SephadexLH20 對黃酮類(lèi)成分的分離效果**，方法很成型，有大量文獻參考。

（7）填料反復使用，每次用完，一般可用甲醇將柱子洗干凈，然后用下一次分離的起步溶劑將甲醇替換出來(lái)，待用。

Sephadex  LH-20是由葡聚糖G-25羥丙基化加工而成，屬于分子篩凝膠，尤其適用于天然產(chǎn)物在有機溶劑中的純化。例如：類(lèi)固醇、萜類(lèi)、脂類(lèi)以及小分子多肽等，Pharmadex  LH-20同時(shí)適用于分子類(lèi)別非常相似的物質(zhì)的分離和工業(yè)規模的制備，既可用于初步純化步驟，也可用于*終精制步驟，如非對映同分異構體的分離。
制備凝膠懸浮液
裝填的重要原則之一就是需要形成一個(gè)穩定均一的柱床。膠顆粒越均一（粒徑分布越窄），越容易獲得穩定均一的柱床。但是對于Sephadex LH-20而言，25～100μm的粒徑范圍相對于許多用于制備色譜的填料而言，不能說(shuō)分布均一，也就是說(shuō)其粒徑分布較寬。然而當膠溶脹后就相對容易得到均一的柱床。這對于長(cháng)柱（*高至250cm）而言也是同樣的。在裝柱前，層析柱和儲槽都必須進(jìn)行徹底的清洗。

Sephadex  LH-20在使用之前必須進(jìn)行溶脹。在溶脹的過(guò)程中，要盡量避免過(guò)分攪拌，否則會(huì )破壞球形膠粒，且要避免使用磁力攪拌器。
1．  在室溫下，將凝膠溶脹于層析溶劑中至少三小時(shí)，溶脹后膠體積的大小決定于所使用的溶劑系統，請參考后頁(yè)之干膠溶脹表計算特定柱體積所需要干膠的量。
2．  使溶脹膠體積沉淀之后占總體積的75%，上層溶劑占25%，這時(shí)，懸浮液從一個(gè)容器倒入另一容器時(shí)膠?？梢苿?dòng)。
3．  將溶脹后的凝膠根據裝柱要求均勻倒入柱內，在保證膠粒不變形的前提下，應在盡可能高的壓力下裝柱，反壓不要超過(guò)1.5ba。
平衡
上樣前，用洗脫液平衡層析柱至少兩個(gè)柱體積直到基線(xiàn)變得平穩為止，如改變溶劑應該注意凝膠在新溶劑中的溶脹性質(zhì)，并根據性質(zhì)確定柱高調節器的位置，如使用相同的溶劑，在以后的層析中柱平衡可以省略。
洗脫液
為確保延長(cháng)層析柱的使用壽命，所有的緩沖液都應該離心或經(jīng)過(guò)0.45um的膜過(guò)濾以除去雜質(zhì)。

樣品
樣品體積應該占柱總體積的1-2%，同樣在使用之前樣品應該離心或經(jīng)過(guò)0.45um的膜過(guò)濾。

洗脫
洗脫流速應根據情況而定，*大張性流速約12cm/min（反壓1.5ba），建議流速為1-10cm/h?？傮w來(lái)說(shuō)，較低的流速，具有較高的分辯率。
再生
凝膠再生通常是先用2-3個(gè)柱體積的洗脫液進(jìn)行清洗，如更換洗脫液，則需要重新平衡。
體積流速與線(xiàn)性流速的關(guān)系
線(xiàn)性流速=體積流速/橫截面積

溶脹體積
由于Pharmadex  LH-20的溶脹體積依賴(lài)于溶劑，所以對于不同直徑的柱可根據比例增加或減少舊柱體積以便計算出新體積。
新體積=舊體積×（新柱體積/舊柱體積）
膠的性質(zhì)
Sephadex  LH-20同時(shí)具備親水和親脂雙重性質(zhì)，且被分離物質(zhì)的極性在分離過(guò)程中起著(zhù)重要作用。
排阻極限  4-5KD（與所用溶劑有關(guān)）
上樣量
吸附模式  取決于所需分辯率
分子量大小  小于總體積的20%
正相分配  小于總體積的1%
其他

膠粒形狀  球形，多孔
顆粒大?。ǜ桑?/span>  18-111um（直徑）
顆粒大小中間值（干）  70um（直徑）
顆粒大?。状迹?/span>  27-163  um（直徑）
顆粒大小中間值（甲醇）  103  um（直徑）
*大線(xiàn)性流速  720cm/min
參考線(xiàn)性流速  60  cm/min
pH的穩定性
操作中  2-11
清洗中  2-13
化學(xué)穩定性  在許多水溶液及有機溶劑系統中都穩定。在pH2以下或強氧化劑中不穩定
高壓**  121℃可忍受20分種
操作溫度  4℃到40℃
保存條件
新填料  4-25℃（干燥）
使用后填料  4-8℃，pH6-8切勿冷凍，加入抑菌劑（如20%乙醇0.04%疊氮鈉）

干膠溶脹表

*包含1%的乙醇

**包含1%的苯

***溶脹膠體積小于2.5ml/g的溶劑沒(méi)有使用價(jià)值

如果Sephadex LH20柱子被弄臟了，大多數情況下是由于樣品沒(méi)濾，將柱頭堵住，或由于樣品的死吸附（一般很少發(fā)生），使柱子的柱頭部分污染，一般的處理是將被污染的柱頭部分的填料棄去，具體做法很簡(jiǎn)單，只將被污染的柱頭部分的填料用玻棒輕輕攪起，倒掉即可。如果柱子整個(gè)被污染，如果是將Sephadex LH20用反相被污染，辦法如下：依次用水，NaOH-NaCl水溶液，水，甲醇洗滌被污染的柱子。因為是整個(gè)柱子被污染，所以污染物一定不會(huì )完全死吸附在柱上（如果完全死吸附在柱上，污染物一定會(huì )只在柱頭部分），所以用合適的溶劑一定可以將之洗下來(lái)。

在更換洗脫溶劑或進(jìn)行調料再生時(shí)，需要特別注意溶劑更換的梯度不可以太大，以避免柱層中出現氣泡或鏤空。如果發(fā)現柱層時(shí)樣品色帶的走行出現明顯的速度不一致，建議重裝柱子。

NaOH-NaCl水溶液配法：8g NaOH 、30g NaCl、1000ml 水