色譜柱的使用及維護

轉自丁香園

1、使用預柱保護分析柱（硅膠在極性流動(dòng)相/離子性流動(dòng)相中有一定的溶解度）。

2、流動(dòng)相使用前必須經(jīng)脫氣和過(guò)濾處理。

3、避免流動(dòng)相組成及極性的劇烈變化。

4、大多數反相色譜柱的pH穩定范圍是2～7.5，盡量不超過(guò)該色譜柱的pH范圍。

5、如果使用極性或離子性的緩沖溶液作流動(dòng)相，應在實(shí)驗完畢柱子沖洗干凈，并保存乙腈中。

6、壓力升高是需要更換預柱或沖洗色譜柱的信號。

系統注意事項

1、開(kāi)、關(guān)系統，流速應有緩沖（1ml/min→0.8ml/min→0.4ml/min→0ml/min），以免壓力突變致使柱頭填料塌陷。

2、流動(dòng)相是緩沖液系統，不要直接切換到強溶劑，突然轉換到高濃度有機溶劑可能會(huì )使HPLC流動(dòng)體系中的緩沖液沉淀，這樣會(huì )導致更大的問(wèn)題如柱頭堵塞、管道堵塞、泵泄漏、活塞損傷或進(jìn)樣閥轉軸失靈。應該先用無(wú)緩沖流動(dòng)相（即把緩沖液換成水），沖洗5～10個(gè)柱體積以后才更換強溶劑。

3、做完測試后切忌直接用100%有機溶劑沖洗柱子，須用90%水-10%有機溶劑（如流動(dòng)相是緩沖液，應用純水或含5%有機溶劑-水溶液）沖洗至少30min后，用有機溶劑沖洗30min左右，*后將色譜柱保存在有機溶劑中。

4、更換色譜柱前，須對使用的色譜柱進(jìn)行沖洗、平衡后，保存在有機溶劑中（*好是乙腈中）。

5、取下色譜柱時(shí)，應立即將兩端封口。

6、除特殊情況外，一般都應使用預保護柱。

平衡色譜柱的原因

反相色譜柱在經(jīng)過(guò)出廠(chǎng)測試后是保存在乙腈/水中的，由于色譜柱在儲存或運輸過(guò)程中可能會(huì )干掉，如不進(jìn)行平衡，樣品中含有的一些鹽、脂質(zhì)、含脂物質(zhì)、腐質(zhì)酸、疏水蛋白質(zhì)和其它一些生物物質(zhì)很容易與HPLC柱發(fā)生相互作用的物質(zhì)，使這些物質(zhì)吸附在色譜柱上，使色譜柱污染。

如何平衡色譜柱？

因此在用流動(dòng)相分析樣品之前，我們應先使用10－20倍柱體積的甲醇或乙腈平衡色譜柱；如果我們所使用的流動(dòng)相中含有緩沖鹽，應注意用純水“過(guò)渡”。平衡過(guò)程中，將流速緩慢地提高用流動(dòng)相平衡色譜柱直到獲得穩定的基線(xiàn)（緩沖鹽或離子對試劑度如果較低，則需要較長(cháng)的時(shí)間來(lái)平衡）。

色譜柱污染后可能出現的情況？

滯留在色譜柱中被吸附的樣品成分累積到一定程度足以使他們開(kāi)始形成新的固定相，有時(shí)候這些分析物能與這些雜質(zhì)作用形成一定的分離機理，這些非目標產(chǎn)物的干擾能被檢測器檢測到而且能形成色譜峰，氣泡，基線(xiàn)擾動(dòng)及基線(xiàn)漂移等現象，在色譜圖上出現“怪峰”，表現為負峰、寬峰、饅頭峰、雙頭峰及前吐舌后拖尾峰和保留時(shí)間會(huì )波動(dòng)。這些行為通常只有通過(guò)平行實(shí)驗才能發(fā)現。

 

色譜柱污染后如何清洗和再生？

當柱子被污染，它的色譜行為和沒(méi)被污染的柱子會(huì )有些不同。被污染的柱子能產(chǎn)生反壓?jiǎn)?wèn)題。被污染的反相柱子必須清洗和再生才能恢復原來(lái)的操作條件。

再生被污染HPLC柱子的關(guān)鍵是知道污染物的性質(zhì)并且能找到適當的溶劑來(lái)去除。如果污染是因為重復進(jìn)樣時(shí)強保留物質(zhì)的累積引起的，利用簡(jiǎn)單的步驟來(lái)除去這些污染物往往能恢復其色譜行為。有時(shí)候，經(jīng)過(guò)多次操作以后的色譜柱用90～100%的溶劑B（雙溶劑反相系統中較強的溶劑）沖洗20個(gè)體積可以**污染物。例如，柱子中殘留的脂質(zhì)就能用非水溶劑如甲醇、乙晴、四氫呋喃。

一般來(lái)說(shuō)，所有的清洗方法都有類(lèi)似的形式。所用的溶劑都是隨溶劑強度增加，經(jīng)常*后一個(gè)溶劑是非常疏水的（如醋酸乙酯甚至是烴），可以用來(lái)溶解非極性物質(zhì)如脂質(zhì)和油類(lèi)。我們必須保證一系列溶劑中每個(gè)溶劑都能與下一個(gè)溶劑互混。清洗過(guò)程要結束時(shí)，必須借助一個(gè)中等強度能互混的溶劑而回到原始溶劑系統。例如，異丙醇是一個(gè)非常好的作為中間步驟的溶劑，因為它能與正己烷或二氯甲烷互溶又能與水相溶劑互溶。但是異丙醇粘度非常大，必須確保較低的流速以免使泵壓過(guò)高。沖洗色譜柱時(shí)，沖洗液由色譜柱出液端直接接入廢液瓶，不能流經(jīng)檢測池，以**測池被污染。

反相色譜柱沒(méi)有使用緩沖溶液，請使用以下溶劑系列再生：

100%甲醇→100%乙腈→75%乙腈-25%異丙醇→100%異丙醇→100%二氯甲烷→100%正己烷→100%二氯甲烷→100%異丙醇→100%乙腈。

反相色譜柱使用緩沖溶液，請使用以下溶劑系列再生：

水→乙腈→氯仿（或異丙醇）→乙腈→水。

表　用來(lái)沖洗的溶劑體積、時(shí)間

色譜柱尺寸  柱體積  所用溶劑的體積  沖洗時(shí)間
　　150-4.6   2.5ml  50ml   50min
　　250-4.6   4.2ml  80ml   80min

每種溶劑至少沖洗20個(gè)柱體積。如250mm×4.6mmHPLC分析柱，可以用1ml/min的流速來(lái)沖洗，沖洗后使用沒(méi)有緩沖的流動(dòng)相進(jìn)行平衡色譜柱。

注：如果簡(jiǎn)單的有機溶劑/水的處理不能夠完全洗去硅膠表面吸附的雜質(zhì)，說(shuō)明色譜柱嚴重污染，沖洗溶劑可以用①0.05M稀硫酸，②二甲基亞砜（DMSO），③二甲基甲酰銨-水（50：50），用低于0.5ml/min的流速沖洗非常有效。