隨著(zhù)對中間體和zui終化合物的反相快速色譜的需求增加，合成化學(xué)家提出了一個(gè)有趣的問(wèn)題。從歷史上看，正相快速色譜一直是合成中間體的“首 選”純化工具。然而，今天，中間體和zui終產(chǎn)品越來(lái)越兩極分化。這些極性反應混合物在使用正相（二氧化硅）進(jìn)行分離和回收時(shí)都面臨純化挑戰，因此需要使用反相快速色譜法。

對于不熟悉該技術(shù)的人來(lái)說(shuō)，反相色譜使用填充有疏水固定相的色譜柱。反相使用的溶劑通常與水混溶，常用的是甲醇和乙腈。其他不太受歡迎的反相溶劑包括四氫呋喃和丙酮。

雖然正相允許使用具有不同選擇性選項的多種溶劑，但反相是有限的。話(huà)雖如此，當改變有機溶劑時(shí)，有時(shí)會(huì )在反相中看到選擇性差異，這可以改善某些化合物的分離——這是本文的主要關(guān)注點(diǎn)。

決定使用甲醇或乙腈的其他變量包括……

- 成本

- 粘度

- 紫外線(xiàn)吸收

成本

如果您曾經(jīng)購買(mǎi)過(guò)溶劑，您可能已經(jīng)注意到，甲醇比乙腈便宜得多，便宜 4 倍，這當然是證明其用于日常反相快速色譜的一個(gè)令人信服的理由。

雖然節省溶劑費用是有道理的，但還應考慮上述其他參數。

粘度

水是極性的并且相當粘稠，至少與大多數溶劑相比是這樣。當與其他溶劑混合時(shí)，粘度會(huì )隨著(zhù)有機物的增加（高達約 50%）而增加，這反過(guò)來(lái)又會(huì )提高背壓，圖 1。

隨著(zhù)有機溶劑百分比增加超過(guò)50%，粘度和壓力會(huì )降低。這很重要，因為在快速純化過(guò)程中增加壓力會(huì )限制流速、增加純化時(shí)間，有時(shí)還會(huì )導致系統超壓。如果這是一個(gè)問(wèn)題，乙腈會(huì )是更好的選擇。

圖 1. 壓力與水中有機溶劑的百分比。當每種溶劑的有機百分比接近50%時(shí)，壓力達到zui大值。

紫外線(xiàn)吸收

大多數溶劑在一定程度上吸收紫外線(xiàn)。然而，水和乙腈在198nm以上是完全紫外線(xiàn)透明的，這是大多數商業(yè)光系統紫外線(xiàn)檢測器的下限。甲醇、四氫呋喃和丙酮都會(huì )吸收且阻礙化合物檢測的紫外光。

選擇性

在評估不同的溶劑混合物時(shí)，并非所有化合物都會(huì )顯示出改變的洗脫模式。但是，如果您發(fā)現有一對化合物在一種溶劑中的分離效果不佳，何不快速評估另一種溶劑呢？

為了幫助說(shuō)明評估不同溶劑所帶來(lái)的好處，我舉了一個(gè)特別有趣的例子。被純化的粗物質(zhì)是一種天然產(chǎn)物提取物，我嘗試首先使用反相和60-100%甲醇-水梯度進(jìn)行純化，圖 2。

該梯度提供了四種zui豐富的化合物的一些分離，但無(wú)法完全分離，使用 Biotage Isolera Dalton 2000 快速系統和12克Biotage Sf?r C18色譜柱將一種 +m/z 為 302.8 的化合物與另一種 +m/z 為 272.8 的化合物進(jìn)行分析。

圖 2. 使用水-甲醇梯度的反相純化。在線(xiàn)質(zhì)量檢測器證實(shí)了 +m/z 272.8 和 +m/z 302.8（粉紅色峰）的化合物未完全分離。

為了改進(jìn)色譜，我將甲醇換成乙腈，并運行 40-100% 的乙腈-水梯度。令我高興的是，乙腈提供了不同的選擇性，在 +m/z 272.8 的化合物之前洗脫了 +m/z 302.8 的化合物，并產(chǎn)生了更好的整體分離，圖 3。

圖 3. 使用水-乙腈梯度對天然產(chǎn)物提取物進(jìn)行反相純化改變了洗脫順序并改進(jìn)了純化?，F在，具有 +m/z 302.8（藍色峰）的化合物比具有 +m/z 272.8（黃色峰）的化合物更早流出。

該數據是否表明乙腈應該是反相中的首 選溶劑？不，盡管它確實(shí)支持在創(chuàng )建反相快速純化方法時(shí)應評估甲醇和乙腈的建議。