高效液相色譜法（HPLC）因其定量分析結果準確、分析周期短、分析范圍廣、分析檢出限低等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)得到了迅速發(fā)展，幾乎可以應用于所有大分子有機物的分析。
可以預見(jiàn)，高效液相色譜儀器的應用將在農業(yè)、輕、重、海、陸、空、食、衣、用等各個(gè)領(lǐng)域無(wú)處不在，無(wú)處不在。但是，如何用好高效液相色譜柱是一個(gè)非常關(guān)鍵的問(wèn)題。
1、高效液相色譜柱及柱外相關(guān)問(wèn)題
1）色譜峰拖尾：與色譜柱、流動(dòng)相流速、樣品等有關(guān)，必須從這些方面找出拖尾的原因。
2）如何延長(cháng)色譜柱的壽命：維護很重要。長(cháng)期不使用時(shí)，用甲醇浸泡。嚴格控制洗柱時(shí)間或洗柱溶劑的體積。一般應使用甲醇（或水：甲醇為20：80）洗滌45分鐘或床體積的20倍。
3）必須注意控制“柱外效應”。所謂“柱外效應”，是指在 HPLC 系統中，由于管子、連接件、進(jìn)樣器、流通池以及柱系統的死體積所引起的色譜峰展寬效應。
4）進(jìn)樣：自動(dòng)進(jìn)樣時(shí)，應經(jīng)常對自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)行檢測，要求儀器進(jìn)樣器穩定可靠；手工采樣時(shí)，要特別注意采樣的細節和感覺(jué)。
2、高效液相色譜柱質(zhì)量
1）色譜柱的柱效：塔板數越高越好，要特別注意影響柱效的因素。塔板數下降到一定程度時(shí)報廢。
2）重復性：當色譜柱重復使用時(shí)，zui大RSD可保持在0.1%以下。
3）耐久性（壽命）：因為柱效容易降低，所以要注意柱子保護。
4）色譜柱使用后必須清洗干凈，以免腐蝕、堵塞、減少塔板數。一般應以床體積的20倍沖洗。 對于每隔幾天使用的HPLC，應先用20%甲醇：80%水洗30分鐘左右，然后再用純甲醇洗20分鐘后保存。
3、流動(dòng)相問(wèn)題
1）pH值特別重要：一般C18柱的pH值小于3時(shí)，很容易損壞色譜柱，但小的pH值可用于耐酸柱。
2）請注意試劑截止波長(cháng)的選擇：如乙腈截止波長(cháng)215nm、丙酮截止波長(cháng)330nm、正丁烷210nm等。
3）流速：流速要合適，否則會(huì )影響峰形，浪費溶劑。一般常規分析通常選擇1ml/min。
4、溶劑預處理 zui好使用HPLC級的溶劑，使用前必須過(guò)濾脫氣。請注意以下事項：
1）過(guò)濾目的： 溶劑進(jìn)泵前和進(jìn)樣前應過(guò)濾除去溶劑中的微小顆粒和微生物，以保證泵和色譜柱不會(huì )堵塞或損壞，分析數據要可靠。
2）對過(guò)濾器的要求及zui大孔徑的選擇方法： 對過(guò)濾器的一般要求：速度快、溶解速度小、死體積小、孔徑精 確、體積合適、化學(xué)相容性好等。
對于孔徑選擇方法：如果柱填料直徑小于3μm或無(wú)菌過(guò)濾，一般選擇0.2μm孔徑；如果柱填料直徑大于5μm，選擇0.45μm；如果是預過(guò)濾或過(guò)濾困難的樣品，一般選擇1μm孔徑。 尤其是用無(wú)機鹽配制的緩沖液，更要注意選擇合適的過(guò)濾器。否則，不可能得到可靠的分析和測試數據。
3）脫氣：
主要目的是去除溶解在流動(dòng)相中或混合產(chǎn)生的氣泡。液相色譜中zui常用的流動(dòng)相脫氣是離線(xiàn)超聲振動(dòng)脫氣、在線(xiàn)惰性氣體鼓泡吹掃脫氣和在線(xiàn)真空脫氣。進(jìn)入液相泵的流動(dòng)相中的氣泡會(huì )引起壓力波動(dòng)，這是非常有害的，必須消除?？梢源蜷_(kāi)排水閥以高流速沖洗。
5、緩沖溶液
1） 緩沖液在使用前必須過(guò)濾。
2）溶劑和樣品容易滋生**和霉菌，因此請對其進(jìn)行清潔。
3）一般有機溶劑不能直接用于清洗和洗滌。
4）梯度洗脫時(shí)，選擇吸光值低的緩沖液，例如：梯度洗脫時(shí)，緩沖液與相應的有機物預混以防止鹽析。在峰不拖尾的情況下，盡量使用低濃度的緩沖鹽，防止鹽析；緩沖鹽濃度一般在20～30mm左右。
如果流動(dòng)相中有機相含量較高，則流動(dòng)相中緩沖鹽的濃度不能太高，鹽濃度至少要保證在流動(dòng)相條件下不會(huì )沉淀。離子對緩沖液的濃度要高一些，一般為50-100mm。
6、噴油器的清潔 對于注射器或注射針，請注意三點(diǎn)：
1）對進(jìn)樣器的要求：自動(dòng)進(jìn)樣，進(jìn)樣速度快，有的儀器進(jìn)樣只需17秒。
2）采樣室要求可控：一般采用Peltier冷卻，溫度控制范圍為4℃-100℃。
3）要特別注意注射殘留物的清潔（主要是清潔針頭）。
